人类皮肤是人体最大的器官，发挥着保护身体、感觉冷热和压力等功能。减少手术切口皮肤愈合过程中的瘢痕增生，甚至达到无瘢痕愈合，尽早恢复皮肤的功能与外观目前受到了广泛的关注，但尚缺乏安全有效治疗手段。因此，寻找减少瘢痕愈合及对于瘢痕愈合的有效治疗方法具有极其重要的临床意义。
羊膜是附着在胎盘胎儿面无血管、神经及淋巴，光滑的半透明薄膜，外敷具有防御功能，减少切口感染率，对创面愈合具有促进作用。本研究通过观察脱细胞人胎羊膜（acellular human amniotic membrane，HAM)在大鼠皮肤全层切口愈合过程中对转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）及凝血酶敏感蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）的表达的影响，探讨切口瘢痕愈合的干预和治疗方法。
1 材料与方法
1.1 脱细胞羊膜的制备及保存 脱细胞羊膜取材来源于产前血清学、输血体检无异常的健康剖宫产产妇胎盘，排除胎粪污染及胎膜早破者。钝性分离羊膜，反复生理盐水冲净血迹，漂洗至透明。置于0.5％SDS中，37℃恒温箱震荡过夜，0.25％胰酶消化24 h，反复磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗，干燥、分装、密封，过氧乙酸毒，-70℃保存备用。
1.2大鼠全层皮肤缺损模型的建立 清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，3月龄，体质量250～300 g，雌雄兼有。大鼠经10％水合氯醛3 mL·kg-1腹腔内 ，脱去背部体毛，生理盐水洗净，碘伏消毒，背脊两侧各做1个直径为1.2 cm圆形全层皮肤缺损，直达深筋膜，建立皮肤切创模型。
1.3 切口处理及取材 将SD大鼠随机分为对照组和脱细胞人胎羊膜组，每组设3、7、14d时相点，每时相每组10个皮损位点。对照组切口用生理盐水冲洗后纱布包裹，隔日换纱布1次，直至14 d。脱细胞人胎羊膜组切口外敷脱细胞羊膜并用纱布包裹。切创处理后单笼喂养。切创3、7、14 d后随机选取每组各5只SD大鼠，过量 药处死，切取切口边缘2 mm正常皮肤至深筋膜正常组织。将标本分为2部分，用PBS冲洗干净，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，备用。
1.4 检测方法 应用免疫组织化学SP法检测TSP-1及TGF-β的表达情况。
1.5免疫组化结果判定 每组10张切片，图片采集使用LEICA显微照像系统，计算机图文分析系统随机选取切片的10个视野（×400），分析阳性区的积分光密度值（IOD）。
每组10张切片，图片采集使用LEICA显微照像系统，计算机图文分析系统随机选取切片的10个视野（×400），分析阳性区的积分光密度值（IOD）。
1. 6统计学处理 采用SPSS13. 0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数标准差（±s）表示，组间均数的比较采用t检验。检验水准α= 0 . 05。
2 结果
2.1 2组TGF-β的表达 结果见表1。TGF-β阳性颗粒主要位于表皮细胞胞质中，第3天对照组TGF-β的表达高于脱细胞人胎羊膜组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7天及第14天，2组TGF-β的表达差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 2组TSP-1的表达 结果见表2。TSP-1阳性颗粒主要位真皮层细胞质和细胞外基质中，阳性表达部位偶见毛细血管样结构形成。第3天对照组TSP-1的表达高于脱细胞人胎羊膜组，差异有统计学意义（P＜0.05）；第7天及第14天2组TSP-1的表达差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
随着剖宫产外科操作技术的快速发展， 安全性能的提高以及人们生育观念的改变，剖宫产率逐年提高[1]。促进患者术后切口愈合，减少瘢痕增生，成为妇产科临床研究的热点问题之一。
羊膜是胎盘的组成部分之一，附着在胎盘胎儿面，因其表面无HLA-A、B、C的表达，仅具有极微弱的抗原性，免疫排斥较弱[2]。人胎羊膜在剖宫产术后过程中容易获得，制备过程简单，具有一定的韧性，已成为皮肤移植，肌肉损伤修复，眼科角膜治疗中的热点材质。本课题的早期研究也提示羊膜覆盖于难愈性会阴侧切口创面，诱导上皮细胞的分化，促进细胞间粘附，减少感染的发生，加速创面愈合[3]。脱细胞人胎羊膜是一种天然高分子生物材料，除去了可溶性蛋白，具有良好的网状支架作用[4]。
TGF-β是TGF-β超家族成员之一。研究发现，TGF-β在炎症反应，组织修复，胚胎发育，细胞生长和免疫调节等过程中均发挥重要作用。TGF-Β可以促进细胞外基质的表达，对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用，在大鼠创伤的第3～4天高度表达。大鼠切创注射TGF-β可以促诱导典型肉芽组织形成。然而，过多的TGF-β的表达是瘢痕疙瘩产生的重要原因。TGF-β1降低瘢痕成纤维细胞中基质金属酶1的表达，以减少瘢痕疙瘩中成纤维细胞的分化[5]。动物实验表明，在成年鼠的创口注射TGF-β多克隆抗体可明显减少大鼠创口处的瘢痕增生[6]。TGF-β在治疗伤口愈合方面具有潜在的应用前景，但由于TGF-β作用机制的复杂性，如何将TGF-β抗体应用于临床，仍需深入的研究。
TSP-1是一种可以由血小板α颗粒、巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞分泌的黏附蛋白，既可以表达于细胞表面，也可以游离状态存在于组织液中，与配体结合后可以介导细胞黏附、抑制血管内皮细胞增殖、激活TGF-β、参与免疫耐受[7] 。TSP-1被广泛认为是抑制血管生成的重要蛋白之一 [8]。TSP-1激活诱导TGF-β的表达的机制在妊娠蜕膜化[9]及诱导成纤维细胞分化的研究中得到了证实。研究表明，通过TSP-1刺激损伤的上皮细胞生产并从细胞外基质中释放TGF-β1，诱导胶原蛋白的合成[10]。
本研究显示出：脱细胞人胎羊膜可以减少大鼠切口组织纤维化代表因子TGF-β及其诱导因子TSP-1的表达，抑制其信号转导，从而促进SD大鼠全层切创的愈合。总之，脱细胞人胎羊膜取材方便，保存及使用方法简单，临床研究及应用必将得到更大的前景。
参考文献
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